叶片是如何长出正反面的？

如果细心观察过植物的叶片，你应该可以轻易分辨出叶片的正反两面：叶片的向阳面（也叫近轴面，即朝向茎的那一面）比较光滑，有比较厚的蜡质层，并且颜色更翠绿一些；而相对的，向地面（远轴面）就要粗糙一些，角质层也薄一些。

叶片的正反两面往往具有很大的差别。图片：shutterstock.com

这些特点是植物针对自己的生存和生理功能演化出的特征，对于植物的光合作用及蒸腾作用来说很有好处。叶片近轴面主要的功能是吸收阳光中的能量，进行光反应，因此叶肉细胞拥有比较多的叶绿素，相对来说，叶片的远轴面就没有那么多的叶绿素了，颜色自然要淡一些。事实上，阳光本身能促进叶绿素的合成，在阳光不足的地方生长的植物就会因为缺乏叶绿素而变得黄黄的。叶片的向地面主要进行光合所需的气体交换，因此叶片背面分布的防止水分散失的角质层自然也薄一些。此外，叶片的正面拥有比较多的叶毛，尤其是在叶片还比较小的时期叶毛相对来说非常丰富，而叶片的反面则相对光滑，叶毛的密度很低——这也是一个很有意思的现象。现在的观点认为这些毛茸茸的结构，包括可以分泌次生代谢物的腺毛，可以保护包含在叶片中间柔嫩的茎顶端分生组织。

那么，如此重要的叶片近-远轴极性是怎么产生的呢？就这一问题，我们在2014年12月30日的《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences）上发表了一篇研究论文。 在该研究中，我们揭示了生长素这一最早被了解的植物激素，在叶片正反面形成过程中的作用。叶片原基背腹面存在生长素浓度差异，而这一差异是导致叶片背腹面分化的主要原因之一。简而言之就是远轴面是“宿命”，而近轴面的形成需要相对较低的生长素浓度。

还是首先让我们从叶片的形成过程开始进一步了解叶片背腹面的分化过程：叶片都是由茎尖的分生组织产生的——分生组织是一团有组织的干细胞，能够不断产生新的器官，而叶片就是一个典型的植物器官；叶片在刚刚从茎尖分生组织分离开的时候并没有明显的近-远轴差异，就是一个小圆包；但很快，叶片的不同区域生长速度出现了不同，远轴面长得快，近轴面长得慢，叶片向茎尖弯曲；同时，伴随着近-远轴的不对称发育，叶片沿着中-边轴向伸展，形成扁平的叶片。层层包被的卷心菜、大白菜中包裹在一起的叶片尚未展开，形成的结构就是这种发育模式导致的后果。

一颗卷心菜的纵剖面。图片：shutterstock.com

既然叶片的近-远轴极性是在叶片刚刚形成时获得的，那么这个信息是怎么来的呢？一个经典的实验提出了解释：极性发育的信息来自于茎尖的干细胞。上世纪四五十年代，曼彻斯特大学的一名研究生依安·萨塞克斯（Ian Sussex）开始关心不同植物茎尖与叶片直接的关系。他选择了土豆作为实验材料，因为土豆不仅容易买到，而且土豆不断生芽，可以方便地削下带着芽的土豆块，修成合适的角度放在显微镜下观察。他用手术刀把即将发生的叶片原基和茎尖轻轻划开一个切口，但是让叶片的其它部位与整体相连：

依安·萨塞克斯在即将发生的叶片原基（I1 c）和茎尖（A）之间切开一个小口，但是底端仍与整体相连。图片：Sussex (1951) Nature 167:651-652.

几天后，他发现这些在近轴面与茎尖分开的叶片很多无法进行正常的近-远轴极性发育。更为显著的是，近-远轴极性发育异常导致叶片无法侧向展开，最终得到的是棒状的叶片，而且叶片各个方向都和远轴面相似。也有些叶片成为“喇叭叶”。这些喇叭叶的顶端像喇叭一样是圆锥形的，喇叭口以下和棒状叶类似，没有极性。萨塞克斯由此推测：茎尖的干细胞产生一个信号，指导叶片近轴面形成。当手术切割阻断这个信号的时候，默认的远轴面发育程序启动，导致叶片只有远轴面发育。这个实验被写入了发育生物学的教科书，而这个信号就被称为了Sussex信号。

Sussex信号似乎很好地解释了极性的来源，可是对于它到底是由什么物质介导的，甚至它是否存在，一直众说纷纭。分子遗传学研究使我们知道了很多编码蛋白和小RNA的基因都存在近-远轴差异分布，但是却没能为Sussex信号提供新的线索。沉寂了近半个世纪后，许智宏先生课题组在上世纪末的一项研究为这个领域带来了一缕曙光。许先生在组织培养的白菜、烟草等多种植物中都发现，加入了生长素（Auxin）的运输抑制剂能够诱发喇叭叶和棒状叶产生。这说明生长素和它的运输与叶片极性发育有关。

生长素是最早被发现的植物激素。达尔文和他的儿子在19世纪末就意识到了一种能够调控植物向光性的激素存在，上世纪中科学家分离到了这种激素，并鉴定出它的化学结构为3-吲哚乙酸（Indole-3-Acetic Acid，IAA）。这种小分子可以由赖氨酸（一种氨基酸）合成得到，虽然对人和其他动物没有什么作用，却对各种植物的发育至关重要：根生长、维管束分化、顶端优势、单性花形成、向光性和向地性都是它的体现。生长素在植物体内的分布很大程度上取决于定向运输，而定向运输依赖与于一类称为PIN的蛋白。

在植物体内，生长素是如何通过PIN蛋白（绿色）从组织的一端传递向另一端的。图片：The Plant Cell/Teaching Tools in Plant Biology

我们最新的研究结果表明，正是PIN蛋白介导的生长素运输产生了叶片极性发育信号，信号的化学本质就是生长素。萨塞克斯根据手术实验得到的推论是正确的，然后也有错误的地方。信号分子（生长素）不是由茎尖干细胞向叶片的近轴面扩散，而是通过主动运输从叶片运向茎尖干细胞。如此看来，萨塞克斯的猜测把方向弄反了。近轴面不是由于积累了生长素，而是由于生长素含量低，而导致近轴面发育的。如果提高了近轴面的生长素含量，近轴面就会发育成为远轴面，从而形成喇叭叶或者棒状叶——和萨塞克斯实验一样的结果！生长素的近-远轴差异非常短暂，叶片发生几天后就会消失，而正是在这几天内，近-远轴分化完成。运向茎尖干细胞的生长素不仅导致了近轴面低生长素区域的建立，也被茎尖干细胞用来起始后续叶片的发生。叶片的发生伴随着生成素高点的依次形成。

生长素运输与假设的Sussex信号方向相反，将生长素运离叶片近轴面，导致近轴面出现低生长素区域。图片：Qi, Wang et al (2014) PNAS 111:18769-18774.

到此为止，事情似乎就已经很圆满了：茎尖的干细胞不断出现生长素的高点，每个高点处产生一片叶；叶片发生后，生长素从近轴面运输回到茎尖，一方面导致近轴面生长素含量低于远轴面，导致近轴面发育，一方面供茎尖干细胞产生下一片叶片。

然而，分子遗传学的研究告诉我们，实际上植物中的近-远轴调控要更为复杂；而以往的分子遗传学研究也确实找出了不少在近-远轴分化中起到重要作用的调控因子。如果将一个植物体比作一辆汽车，植物体内的基因就是一个个汽车零件。 当汽车的某个零件被卸掉之后，汽车无法转向，就可以得出结论该零件为汽车转向所必须。而分子遗传学研究正是通过类似的方法来找出植物特定发育过程中的必须“零件”——当一些基因通过随机诱变的方法被“卸掉”，如果出现叶片极性发育的问题，比如植物长出喇叭叶，就说明被卸掉的基因在叶片极性发育过程中起作用。如果我们再能够往回追溯找出是哪个基因被“卸掉”，那么我们就知道这个基因能够调控叶片极性发育。

一批这样的基因就通过分子遗传学的办法被发现了，其中很多基因编码转录因子。转录因子调控其它基因的转录，就像军队里大大小小的指挥官，控制着或多或少的下游基因。这些转录因子有些在近轴面特异表达，有些在远轴面特异表达。它们在自己表达的区域号令下游的基因军团，最终形成了近-远轴截然不同的发育模式和生理功能。

控制叶片近-远轴极性建成的，远非只有生长素这一个因素。图片：shutterstock.com

也有些基因直接或间接地影响特定的小RNA (microRNA, miRNA 和一种特殊的trans-acting short interfering RNA, tasiRNA) 。这些小RNA是植物自身基因组编码表达的，它们的出现比较偶然，比如miRNA最初可能来源于基因内部核苷酸突变导致的反向转录，但在漫长的进化过程中这些miRNA已经被整合到植物的发育程序中，像许许多多的转录调控因子一样，成为植物发育网络中不可或缺的枢纽。小RNA能够直接作用于序列互补结合其它基因从而抑制这些靶基因的转录、翻译或是促进靶基因的降解。叶片发育过程中，在近-远轴面分别表达不同的小RNA，作用于编码转录因子的基因，以使这些靶基因只能在叶片的一侧分布。

有一些转录因子在叶片近-远轴的极性分布出现得很早，从时间上来看似乎不晚于生长素的极性分布，因而这类调控因子可能并不受生长素的影响。如此看来，也许有两套平行的叶片调控机制在共同起作用。这些转录因子和小RNA间又存在着复杂的相互调控和牵制，盘根错节，它们和生长素在小小的叶片原基中纠缠在了一起。

那么，自然为什么要选择这么复杂的调控方式呢？对这些基因调控网络的数学建模和模拟显示，复杂的调控更为稳定，而不容易受到环境条件轻微变化和植物内单个信号通路突变的影响，一种方式失败了，另一种方式可以非常迅速地弥补上来。叶片两面不同的发育也许同样需要多种方式来调控，而这些多种方式的共存并立使得叶片的两面发育更稳定。否则，也许我们会频繁看到不正常的叶片出现，而这样的植物由于光合效率受累也容易出现其它的发育问题。至于这些通路之间到底存在着怎样一种和谐而对立的关系，什么机制保障了它们之间有序有效的协作，还有待分子遗传学研究带给我们进一步的答案。